Gen Aktarim Teknikleri

GEN AKTARIM TEKNIKLERI

Gen tedavisinde, etkin bir gen aktarimi en onemli bir kosuldur. Genleri istenilen hucrelere tasiyabilmek icin kullanilan yontemler genel olarak iki kategoride toplanmaktadir: Fiziksel yontemler ve biyolojik vektorler:

 Fiziksel yontemler, DNA’nin dogrudan dogruya enjeksiyonu, lipozom formulasyonlari ve balistik gen enjeksiyonu yontemlerini icerir. Dogrudan DNA enjeksiyonunda ilgili gen DNA’sini tasiyan plazmit, dogrudan dogruya, ornegin kas icine, enjekte edilir. Yontem basit olmasina karsin kisitli bir uygulama alani vardir.
Lipozomlar, lipidlerden olusan molekullerdir. DNA’yi iclerine alma mekanizmalarina gore iki guruba ayrilirlar: Katyonik lipozomlar ve pH-duyarli lipozomlar. Birinci gurup lipozomlar arti yuklu olduklarindan, eksi yuklu olan DNA ile dayanikli bir kompleks olustururlar. Ikinci gurup lipozomlarsa negatif yuklu olduklarindan DNA ile bir kompleks olusturmaz, ama iclerinde tasirlar. Parca bombardimani ya da gen tabancasi olarak da adlandirilan balistik DNA enjeksiyonu, ilk olarak bitkilere gen nakli yapmak amaciyla gelistirilmistir. Bu ilk uygulamalarindan sonra, bazi degisiklikler yapilarak memeli hucrelerine gen nakli amaciyla kullanilmaya baslanmistir. Bu yontemde, genellikle altin ya da tungstenden olusan 1-3 mm boyutunda mikroparcaciklar, tedavi edici geni tasiyan plazmit DNA’si ile kaplanir, sonra da bu parcaciklara hiz kazandirilarak, hucre zarini delip, iceri girmeleri saglanir.

Basit olmalarina karsin fiziksel yontemler verimsizdir; ayrica, yabanci genler, sadece belirli bir sure fonksiyonal kalabilmektedirler. Bu nedenle arastirmacilarin cogu, genellikle virus kokenli vektorlere yonelmislerdir. "Vektor" kelimesinin bir anlami da "tasiyici"dir. Benzer sekilde, gen terapisinde genleri hucrelere tasima amaciyla kullanilan ve genetik olarak zararsiz hale getirilmis viruslere de vektor denir.

Gunumuzde yapilan arastirmalarda, viruslerin hastaliga yol acan gen parcalarinin yerine, hastalari iyilestirme amaciyla rekombinant genler yerlestirilmektedir. Bu amacla degistirilmis hucreler kullanilmaktadir. Bu hucrelere tedavi edici geni tasiyan bir genetik yapi sokuldugunda, tedavi edici geni icinde tasiyan virusler elde edilir. Bu sekilde degistirilmis virusler hucreye girmek icin kendi yontemlerini kullanirlar ve genomlarinin ekspresyonu sonucu, genin kodladigi protein uretilmeye baslanir. Ote yandan, virusun kendisini cogaltmak icin ihtiyac duydugu genler, tedavi edici genlerle degistirilmis oldugundan, virus cogalip hucreyi patlatamaz. Bunu yerine, hucrede virusun tasidigi hastaligi duzeltici genin ekspresyonu olur, genin kodladigi protein (yani ilac) uretilir ve genetik bozukluk nedeniyle uretilemeyen proteinin yerini alir.
En cok kullanilan viral vektorler, retrovirusler, adenovirusler, herpesvirusler (ucuk virusu) ve adeno-iliskili viruslerdir. Ama her vektorun kendine ozgu dezavantajlari vardir: Bolunmeyen hucreleri enfekte edememek (retrovirus), olumsuz immunolojik etkiler (adenovirus), sitotoksik etkiler (herpesvirus) ve kisitli yabanci genetik materyal tasiyabilme kapasitesi (adeno-iliskili virus). Ideal bir vektorde aranan ozellikler yuksek titraj, kolay tasarlanabilme, integre olabilme yetenegi ve gen transkripsiyonunun kontrol edilebiliyor olmasinin yaninda, imunolojik etkilerin olmamasidir.
Gen aktarim teknikleri

 Viral Vektorler                               

1. Retroviral vektorler                      2. Adenoviral vektorler                  

3. Adeno-asociated virus                  4. Herpes Simpleks Virus Tip-1        

5. Polio Virus                                  6. Ordek Hepatit Virusu                  

7. Parvovirus                                  8. Sendaivirus                              

9. Sindbis virus                       

 Fiziksel ve Kimyasal Yontemler

1. Transferin-reseptoru araciligi ile     2. Asiaglikoprotein DNA konjugatlari

3. Lipofection                                  4. Direk aktarim

5. Kalsium fosfat cokturmesi ile        6. Diethilaminoetil dekstran

7. Elektroporasyon                          8. Sonikasyon

9. Kazima yontemiyle                     10 Polibrene/dimetilsulfoksid

11 Jet injeksiyon                            12 Partikul bombardimani

Genlerin vucuda yerlestirilmesi yontemleri

Genleri vucuda yerlestirmenin cesitli yollari vardir. Genel olarak, gen tedavisi iki esas bolumde siniflandirilabilir.

l. ex vivo yaklasim: Bu yaklasimda hucreler vucuttan alinir; in vitro kosullarda gen transferi yapilir. Tekrar vucuda geri verilir. Bu yaklasimin avantajlari sunlardir:

a. Gen aktarimi genel olarak yuksektir.

b. Eger vektor secilebilir marker gen tasiyorsa; gen aktarilan hucreler  zenginlestirilebilir.

c. Re-implantasyon oncesinde etkinlik kontrol edilebilir.

2. in vivo yaklasim: Vucuttaki hucrelere genlerin direk transferidir. Bu aktarim, in vitro kosullarda gerceklestirilir ve hucreler aliciya tekrar geri verilerek yapildigi gibi alicinin dokusuna in situ direk aktarim seklinde de yapilabilir. Ayrica henuz kullanilmamakta ise de bir vektor araciligi ile de kan yoluyla aktarim gerceklestirilebilir. Bu vektorler plasmidin konakci hucrede takibini saglayacak sekilde floresans ile isaretlenebilir. En onemli sorun spesifiklik ve duragan gen transferinin dusuk etkinligidir. Bu klinikde arka arkaya tedavi islemlerini gerektirmektedir.

Gen tedavisinde antisens oligonukleotid kullanimi

Antisens oligonukleotidler, kucuk sentetik nukleotid dizileri olup; bunlar spesifik DNA veya RNA dizilerine komplementerdirler. Eksojen oligonukleotidler nukleik asit baglayici reseptorler araciligi ile hucre icerisine alinirlar. Terapotik urun olarak hazirlanmalarinda baslica sorun hucre icerisine tasinabilmeleridir. Oligonukleotidlerin gen tedavisinde kullanilmasi ‘eger belirli bir gen bir hastaliktan sorumlu ise; bunun calistirilmamasi klinik anormalligin duzelmesini saglayabilir’ prensibinden yola cikarak tasarlanmaya baslanmistir. Antisens oligonukleotidler genin cevrilmesini durdurarak hastaliga neden olan genlerin ekspresyonunu engelleyen yapilardir. Bu yapilar onkogenleri kontrol altina alabilmekte ve virus DNA’sinin cevrilmesini engelleyebilmektedirler.
 

Bir cok ilacda amac defektif veya istenmeyen proteinin sentez edildikten sonra fonksionuna engel olmaktir. Antisens teknolojide amac protein sentezinin spesifik kisa tek sarmal DNA veya RNA dizileri kullanilarak onlenmesidir.

 Bu onleme, protein sentezinin:

1) Genomik DNA’nin mRNA’ya transkripsiyonunda

2) mRNA’nin proteine translasyonu sirasinda mumkun olabilir.

Sitoplazmik mRNA, DNA ‘ya oranla daha kolay bir hedef gibi gorunmektedir. Bu yaklasimla, c-myc geni/lenfoma hucre dizileri bcr-abl/ Kronik Myelositer Losemide blast hucrelerinde denemeler yapilmistir. In vitro calismalarda, anormal mRNA olusturan Burkitt lenfoma hucre dizilerinin cogalmasi antisens oligonukleotidlerle durdurulmustur. Antisens oligonukleotidler, hucre dizilerinin kanserlesmesini veya metastatik potansiyellerini azaltir.
 

Anti-sens olarak gelistirilen ve AIDS’li hastalarda olusan sitomegalovirus retinitini tedavi edecek olan ilac intra vitreal enjeksiyonla 1998 yilinda insanda kullanilmaya baslanmistir.
Oligonukleotid ile gen modifikasyonu

Amac DNA’da var olan hatanin, yapisal DNA hatasina donusturulerek, tamir mekanizmasinin taniyabilmesini saglamaktir. 20 bazlik bir oligonukleotide baglanan bir alkile edici ajan, ikili helikse yapisir. Tek iplikcikli oligonukleotid hedef DNA’da kendisine uyan bolgeye yapisir. Replikasyon sirasinda, hucre tamir mekanizmalari devreye girer ve duzeltmeyi yapar.

Bu metod ile obesite, b-adrenerjik reseptor mutasyonu, Hb S ve kistik fibrozisin gen tedavisi calismalari yapilmaktadir.
Genetik immunomodulasyon:

Genetik immunomodulasyon, gen tedavisinde sitokinleri kodlayan genlerin vektorler araciligi ile aktarilmasini kapsamaktadir. Sitokinlerin, klinik olarak tumor buyumesi uzerine onemli etkisi vardir. Immun sistemde yapilacak modifikasyonla, konakcinin antitumor immun yaniti gelistirilebilir. Tumor infiltre eden lenfositlere TNF geni aktarilmasi modeli bunun bir ornegidir.
Ilac hedeflemesi:

Gen tedavisinde kullanilan vektorlerin spesifik olarak hastalikli hucrelerde eksprese olurken normal hucrelerde bunun olusmamasi temel amactir.

 Degisik doku ve hucrelerde gen tedavi yaklasimlari asagida ozetlenmistir.

Kemik iligi: Kemik iligi transplantasyonu icin gerekli olan teknik islemlerin ve tedavinin gelistirilmesi ile hematopoetik sistem gen tedavisi icin uygun bir aday doku olmustur. Pluripotent hematopoetik kok hucre, kemik iligi hucrelerinin %0.01-0.1’i kadardir. Pluripotent olmasi ve kendiliginden yenilenmesi, ideal bir hedef doku halini almasini saglar. Ex vivo tedavinin en guzel ornegidir. Bir kac hucreye bir gen aktarimi olmasi halinde dahi, aktarilan genin surekli varligi mumkun olacaktir. Yuksek sinif hayvanlarda, bu hucrelerin enfekte edilmesi guctur. Kemik iligindeki bag dokusu hucrelerinin etkin transferde onemli rolu oldugu gosterilmistir. Kemik iliginin gen tedavisi icin ilk hedef doku olmasinin nedenleri soyle siralanabilir.

1- Kemik iligi hucreleri kolayca elde edilebilir.

2- In vitro olarak calisilabilirler.

3- Bireye tekrar reinfuze edilebilirler.

4- Infuzyon sonrasi organizmada cogalarak, farklilasmaya ugrarlar. Boylece organizmada yeni bir hucre populasyonu olusturulabilir.

Kas: Cok sayida hedef hucreye gereksinim oldugundan; yuksek etkinlikte gen transferine ihtiyac vardir. Retrovirusla infekte edilen primer myoblastlarin hayvan kasi icine zerk edilmesi ile alti aylik bir surenin uzerinde gen ekspresyonu saglanmistir. En onemli dezavantaji, myoblastlarin zerk edildigi bolgede kalmasidir. Adenovirus vektorunun intravenoz olarak sicana verildikten sonra, etkin bir transduction hem kas fibrillerinde, hem de diger dokularda saglanmistir. Kas fibrillerinin in vivo direkt gen aktarim teknikleri icin de kullanilabildigi gosterilmistir. Plazmid DNA’nin iskelet ve kalp kaslarina direkt zerki ile duragan gen ekspresyonu saglanmistir. Bu zerk edilen plazmid DNA’si hucrede episomlar olarak bulunmaktadir. Bu prosedur, primatlarda cok etkin degildir.Insan buyume hormonu genlerinin transferi ile de hayvanlarda bu hormonun duzeyleri uc ay sonra belirlenebilmistir.

Karaciger: Hepatositleri, kultur ortaminda manuple etmek oldukca guctur. Cunku bu hucreler kultur ortaminda cok az bolunmeye ugrarlar ve retroviral vektorlerle transduction etkinligi %20-25 gibi dusuk duzeylerdedir. Her ne kadar in vivo olarak, hepatositler normal kosullarda bolunmezken, kismi hepatektomi, hepatositlerin hucre bolunmesini aktive eder. Bunu takiben retrovirus vektorunun in vivo perfuzyonu ile cok sayida hepatosit infekte edilebilir. Ancak etkinlik %1-2 civarindadir. Alfa-1- antitrypsin geni intraportal yolla adenoviral vektorle karacigere aktarilmissa da, genin ekspresyonu kisa surmustur.

Santral sinir sistemi: Yapisal ve fizyolojik kompleksligi nedeni ile SSS bozukluklarinda somatik gen tedavisi uygulanmasi beraberinde onemli sorunlari da getirmektedir. HSV-1 vektorleri hem in vivo, hem de ex vivo olarak sinir hucrelerinde aktarimda kullanilmistir.

Trakea epiteli: Bu hucrelerin organizma disina alinip, kulture edilmesi ve sonra tekrar organizmaya implante edilmesindeki zorluklar nedeni ile in vivo aktarim kullanilmaktadir. Adenoviral vektorler ile trakea epiteline invivo gen aktarimi, sicanlarda basarilmistir.

Lenfosit: Adenosine Deaminaz enzim eksikliginde kullanilmistir. T hucrelerinin yasam surelerinin sinirli olmasinin nedeni ile arka arkaya infuzyona ihtiyac bulunmaktadir. AIDS ve kanser tedavisinde en uygun hedef doku olarak ortaya cikmaktadir.
 Okuler hucreler: Vitroz icine adenovirus araciligi ile gen aktarimi yapilmistir.

Periferik kan progenitor hucreler: Kemik iligi yerine, periferik kandan izole edilen progenitor hucrelere gen transfer edilmesi ile uzun sureli hematopoesis saglanmistir.

Umbilikal ven epiteli: Umbilikal ven epiteline "Doku Faktor" transferi yapilmistir.

Gen Terapisinin Cozum Bekleyen Sorunlari:

Ilk sorun, genlerin insana verilmesini saglayacak daha kolay ve etkili yontemlerin bulunmasidir. Bir baska sorunsa, nakledilen genin hastanin genetik materyalinin hedeflenen bolgesine yerlesmesini saglamak ve boylece olasi bir kanser ya da baska bir duzensizlik riskini ortadan kaldirmaktir. Bu konudaki baska bir sorun da, yerlestirilen yeni genin vucudun normal fizyolojik sinyalleriyle etkin bir bicimde kontrolunun saglanmasidir. Ornegin insulin, dogru zamanda ve dogru miktarda uretilmedigi zaman, hastaya yarar yerine zarar getirecektir. Su ana kadar yapilan calismalar sonrasi iyi sonuclar alinabilmis fakat kalici tedavi cogu zaman basarili olamamistir. Bunun bir nedeni, vektorlerin tasidiklari genin uzun sureli ekspresyonuna izin vermeyisleri, digeriyse denemelerde etkinlikten cok guvenligin on plana cikmasidir.

Su anki duruma gore, onumuzdeki yillarda gen tedavisindeki egilim, genleri istenilen hucrelere en etkin bicimde tasiyabilecek vektorlerin dizayn edilmesi yolunda olacak gibi gorunuyor. O zaman, gen tedavisinin daha basarili sonuclar verecegi soylenebilir.
 

Kaynak: Farmakoloji AD
belgesi-773