Belgeci.com – Bilgi Paylaştıkça Çoğalır

Analinizi yapılacak olan örnek sabit sıcaklıkta sırasıyla a-amilaz, proteaz ve amyloglukosidaz enzimleri ile enzimatik doyurulur.

a-amilaz (Sıcaklığa dayanıklı)

Proteaz: MES/TRIS tamponu ile 50 mg/ml’lik çözeltisi hazırlanır. Bu çözelti deney yapılacağı zaman taze hazırlanmalıdır.

MES/TRİS tamponu: 19.52 g 2(N-morfolin)etan sülfonik asit (MES) ve 14.2 g tris(hidroksimetil)aminometan (TRİS) 1.7 L deiyonize suda çözülür. Çözeltinin pH’ sı 6 N NaOH ile 8.2’ ye ayarlanır.

0.561 N HCl asit çözeltisi: 700 mL saf su üzerine 93.5 ml 6 N HCl asit koyularak 1Lt ye tamamlanır.

Yaklaşık 1 g ( M) yağsız – örnekteki yağ uzaklaştırılmalıdır- deney numunesinin (deney iki paralelli götürülmelidir) üzerine 40 ml MES/TRIS tamponu eklenir. 200 mL sıcaklığa dayanıklı a-amilaz eklenerek 100 °C ‘de 35 dakika bekletilir. Daha sonra 100 mL proteaz enzimi eklenerek 60 °C ‘lik su banyosunda yarım saat bekletilir. 0.561 N HCl ile çözeltisinden 5 ml eklenerek çözeltinin pH’sı 4.1- 4.8 aralığına getirilir. 300 mL amilo glukosidaz eklenerek tekrar 60°C ‘lik su banyosunda yarım saat bekletilir. Çözelti vakum altında sabit tartıma ( m₁) getirilmiş gooch krozesinden (cam kroze) süzülür. Çökelek 70°C sıcaklıkta 10 ml su ile iki kere yıkanır.

Kalıntıda çözünmeyen, süzüntüde çözünen diyet lif analizi yapılır.

Kalıntı, 10 ml %95 ‘lik etanolle iki kere ve son olarak 10 ml asetonla iki kere yıkanır.

Sabit tartıma getirilmiş cam krozede kalan kalıntı 105 °C’de sabit ağırlığa gelene kadar etüvde bekletilir. Desikatöre alınıp soğutulur ve tartılır (m₂). Paralel olarak yürütülen deney sonucunda tartımları alınmış örneklerden birinde kül ( k), diğerinde protein (p) analizi yapılır.

Süzüntünün ağırlığı 80 g olana kadar üzerine saf su eklenir. Önceden 60°C’ye ısıtılmış % 95 ‘lik 320 ml etanol eklenir. Çökme işleminin tamamlanması için 1 saat bekletilir. Çözelti sabit tartıma getirilmiş gooch krozesinden (cam kroze) süzülür. Kalıntı, 20 ml %78 ‘lik etanolle 3 kere, 10 ml %95 ‘lik etanolle iki kere ve son olarak 10 ml asetonla iki kere yıkanır.

Sabit tartıma getirilmiş cam krozede kalan kalıntı 105 °C’de sabit ağırlığa gelene kadar etüvde bekletilir. Desikatöre alınıp soğutulur ve tartılır (m₃). Paralel olarak yürütülen deney sonucunda tartımları alınmış örneklerden birinde kül (k), diğerinde protein (p) analizi yapılır.

Eğer toplam diyet lif aranıyorsa 300 mL amilo glukosidaz eklenerek 60°C ‘lik su banyosunda yarım saat bekletildikten sonra %95 lik etil alkolden 225 ml eklenerek 60°C ‘lik su banyosunda altmış dakika bekletilir. Çözelti süzülür. Kalıntı, 20 ml %78 ‘lik etanolle 3 kere, 10 ml %95 ‘lik etanolle iki kere ve son olarak 10 ml asetonla iki kere yıkanır.

Sabit tartıma getirilmiş cam krozede kalan kalıntı 105 °C’de sabit ağırlığa gelene kadar etüvde bekletilir. Desikatöre alınıp soğutulur ve tartılır (m₄). Paralel olarak yürütülen deney sonucunda tartımları alınmış örneklerden birinde kül (k), diğerinde protein (p) analizi yapılır.

Ağırlıkları bulunan kalıntılardan doğru sonuca varabilmek için, bulunan kül ve protein toplam miktarları çıkarılır.

% Toplam diyet lif = [(m₄ – m₁) –( k+ p ) x100] / M

% Çözünmeyen Diyet Lif = [(m₂ – m₁) –( k+ p ) x100] / M

% Çözünen Diyet Lif = [(m₃ – m₁) –( k+ p ) x100] / M

m₁ = Sabit tartıma getirilmiş gooch krozesinin ağırlığı (g)

m₂ = Sabit tartıma getirilmiş gooch krozesi + çözünmeyen diyet lifteki kalıntının ortalama  ağırlığı (g)

(m₂ + m₂’ )/ 2 örnek iki paralelli yürütüldüğü için

m₃ = Sabit tartıma getirilmiş gooch krozesi + çözünen diyet lifteki kalıntının ortalama ağırlığı

(m₃ + m₃’ )/ 2 örnek iki paralelli yürütüldüğü için

m₄ = Sabit tartıma getirilmiş gooch krozesi + toplam diyet lifteki kalıntının ortalama ağırlığı

(m₄ + m₄’ )/ 2 örnek iki paralelli yürütüldüğü için

M = (M₁ + M₂) /2 örnek 2 paralelli götürüldügü için ortalama örnek ağırlığı (g)