2. BESİYERİ BİLEŞİMİNE GİREN MADDELER
Besiyeri bileşimine giren maddeler gelişme açısından; a) Gelişme için gerekli olanlar, b) inhibitörler olarak 2 gruba ayrılabilir. Gelişme için gerekli olan maddeler doğrudan mikroorganizmaların beslenme şekilleri ile ilgilidir ve bu maddeler besiyeri içinde bir anlamda zorunlu olarak bulunurlar. İnhibitörler ise gelişmesi istenmeyen mikroorganizmalar için gerektiğinde selektif besiyerlerine ilave edilirler.
Besiyerlerine giren kimyasal maddeler hakkında aşağıda kısaca bilgi verilmiştir.
Besiyeri hazırlamada kullanılan suyun; distilasyon veya deiyonizasyon ile taze hazırlanmış olması, başta bakır olmak üzere toksik metallerden arı olması gerekir. İyon değiştirici reçineden geçirilerek elde edilen deiyonize (= demineralize) su kullanıldığında bu suyun içinde yüksek sayıda mikroorganizma bulunabileceği dikkate alınmalıdır. Destile (= Distile) su için en ideali cam sistemlerin kullanılmasıdır.
Gerek deiyonize, gerek destile su eldesinde saf su sisteminin ve benzer şekilde saf suyun depolandığı kapların belirli aralıklarla temizlenmesi gerekir.
Taze hazırlanmış saf suyun pH’sı 6,5-7,5 arasında olmalıdır. Depolanmış saf su atmosferik karbondioksitin absorbe edilmesi sonucu asit pH gösterir. Eğer saf suyun pH’sı 5,5’in altında ise bu su ısıtılarak CO2 uzaklaştırılır ve pH yeniden kontrol edilir. Eğer pH hala düşük ise NaOH ile saf su nötral pH ‘ya getirilir ve saf su sistemi kontrol edilir. Besiyeri hazırlamada kullanılan su, asit özellik gösteriyor ise ve besiyeri bileşimde bikarbonat tamponlar varsa bunları etkileyerek hazırlanmış besiyerinde bir takım olumsuzluklara yol açabilir.
2.2. Peptonlar
"Pepton" deyimi ilk kez 1880 yılında Nageli tarafından kullanılmıştır. Nageli, kemoorganotrof mikroorganizmaların kısmen parçalanmış (hazmedilmiş = sindirilmiş = digested) protein içeren besiyerinde iyi geliştiklerini ilk açıklayan bakteriyologdur. Bugün pepton deyimi, proteinlerin hidrolizi ile elde edilen ürünlere verilen genel isimdir.
Yaşayan tüm hücreler gibi mikroorganizmalar da azot, karbon, tuzlar ve diğer besin maddelerine gereksinirler. İstisnalar dışında mikroorganizmalar genel olarak proteini azot kaynağı olarak kullanamazlar ve azotlu bileşikleri daha kolay kullanabilecekleri protein hidrolizatlarına gerek duyarlar.
Peptonlar sadece azot değil, aynı zamanda karbon kaynağı olarak da mikroorganizmalar tarafından kullanılırlar. Bunun yanında peptonların bileşiminde
bulunan bazı aminoasitler ve vitaminler bazı mikroorganizmaları için gelişme faktörü olarak işlev görürler.
Proteinler; kuvvetli asitler, kuvvetli alkaliler ile ya da enzimatik olarak temel bileşenleri olan peptit ve amino asitlere ayrışırlar. Bu amaçla en çok kullanılan proteolitik enzimler papain, pepsin ve pankreatin’dir.
Peptonlar çeşitli ticari firmalar tarafından çeşitli hayvansal dokulardan, sütten ve soyadan farklı yöntemlerle elde edilirler ve farklı ticari isimler ile pazarlanır ve/veya dehidre besiyerleri içine ilave edilirler. Hammadde ve üretim yöntemi farklılığı doğal olarak peptonların bileşimlerinde farklılıklar oluşturur. Dolayısı ile farklı amaçlar için farklı peptonlar kullanılır.
2.3. Ekstraktlar
2.3.1. Maya Ekstraktı
Maya ekstraktı (maya özütü = yeast extract) otolize edilmiş (parçalanmış) bira mayasının (Saccharomyces cerevisiae) sulu ekstraksiyonu ile elde edilir. Özellikle yüksek B kompleksi vitamin konsantrasyonu nedeniyle çoğu mikroorganizmanın iyi bir şekilde gelişmesini sağlar. Bileşimindeki amino asitler, peptidler, vitaminler, karbohidratlar ve mineraller sayesinde pek çok mikrobiyolojik çalışmada kullanılır. Doğal karbohidratları nedeniyle fermentatif çalışmalarda kullanılmaz.
2.3.2. Et Ekstraktı
Et ekstraktı (et özütü= meat extract = beef extract = lab lemco powder) genellikle yağı ve tendonları ayrılmış, ekstraksiyon öncesi hafifçe hidrolize edilmiş etten elde edilir. Karbohidrat içermez. Bu nedenle fermentasyon çalışmalarında kullanılabilir. Besiyerlerinde et peptonları yerini alabilir.
2.3.3. Malt Ekstraktı
Malt ekstraktı (malt özütü = malt extract) biralık arpadan elde edilir. Başta maltoz olmak üzere çeşitli karbohidratların yüksek konsantrasyonuna bağlı olarak maya ve küflerin geliştirilmesi için kullanılır.
2.3.4. Beyin ve Kalp Ekstraktı
Beyin ekstraktı (= brain extract) ve kalp ekstraktı (heart extract) zor gelişen (= fastidious) patojen bakterilerin (streptokoklar, pneumokoklar, meningokoklar, gonokoklar vs) geliştirilmesi için besiyeri bileşimine katılır (Brain Heart Broth, Brain Hearth Infusion).
2.3.5. Pirinç Ekstraktı
Pirinç ekstraktı (rice extract), başta Candida türleri olmak üzere mayaların ayrımında kullanılan Rice Extract Agar ‘ın bileşimine girer. Bu besiyerinde besin maddesi olarak sadece pirinç ekstraktı bulunur.
2.4. Jelleştiriciler
2.4.1. Agar
Besiyerlerinin katı hale getirilmesi için en çok kullanılan jelleştirici agar (= agar agar)’dır. Agar, bir poligalaktozid olup "agarophytes" olarak tanımlanan bazı kırmızı deniz yosunlarından (Gellidium, Eucheuma, Gracilaria, Acanthopeltis, Ahnfeltia, Pterocladia türleri) elde edilir. Bazı hidroksil grupları sülfürik asit ile esterifiye edilmiştir.
Katılaştırma (= jelleştirme) özelliğini bileşimindeki D-galakton sağlar. Bileşiminde ayrıca inorganik tuzlar, çok az miktarda protein benzeri maddeler ve eser miktarda yağ vardır. Mikrobiyolojide kullanılan agarlar özel olarak saflaştırılırlar ve antimikrobiyel maddelerden arındırılırlar.
Agarın bileşimindeki agaroz ve agaropektin adlı 2 polisakkarit agarın etkisini belirler. Agaroz, agarın yüksek jelleştirme özelliğinden sorumlu iken, agaropektin viskoz özellikler verir. Agardaki agaroz : agaropektin oranı hammaddelere göre değişmekle beraber agaroz oranı % 75’e kadar çıkabilir.
Agar, besiyeri bileşimine sadece jelleştirici olarak katılır. Bir kaç istisna dışında mikroorganizmalar için agar, uzun ve dallanmış zincir yapısı nedeniyle mikroorganizmalar için besin maddesi değildir.
Agar, 85 oC’da erir, 40 oC’da jelleşir. Gerek erime, gerek jelleşme sıcak-lığına ortamın pH’sı etkilidir. 5’in altındaki pH ‘larda agar jelleşme özelliğini yitirir.
Agarın jelleşme sıcaklığı literatürde 32-36 oC ve 32-39 oC olarak verilmektedir. Bununla beraber, petri kutularına döküm sırasında petri kutularının oda sıcaklığında (20 oC) olduğu ve dolayısıyla petri kutusu ile besiyeri arasında ısı değişimi olacağı dikkate alınarak döküm sıcaklığının 40 oC kadar olması gerekir.
Agar, besiyerine amaca göre % 0,05-3 gibi geniş bir sınırda ilave edilebilir. Düşük agar konsantrasyonları (% 0,05-0,3) genellikle hareketliliğin belirlenmesi, mikroaerofillerin geliştirilmesi vb özel amaçlarla kullanılır. Standart kullanım konsantrasyonu %1-1,5’dur. Yüksek konsantrasyonlar ise yüksek asitli besiyerlerinde agarın jelleşme özelliğini göreceli olarak geri kazanması amacıyla kullanılır.
2.4.2. Jelatin
Mikrobiyolojinin gelişme yıllarında ilk kez Robert KOCH tarafından jelleştirici olarak kullanılan jelatin bu gün daha ziyade proteolitik aktivitenin belirlenmesi amacıyla kullanılmaktadır.
Kollegen protein yapısında olup fermente olabilir karbohidratları içermez. Jelleştirici olarak besiyerine ilave edildiğinde jelatinin ısıya duyarlığı nedeni ile 115 oC ‘da 10 dakika gibi düşük sterilizasyon normu kullanılmalıdır. Jelatin, 121 oC’da sterilizasyonda ise jelleşme özelliğini kayda değer ölçüde yitirir. Besiyeri bileşimine % 12-15 düzeyinde katılır. Yaklaşık 28 oC ‘da eridiğinden jelatin kullanılan besiyerleri 28 oC ‘ın altında inkübe edilmelidir.
2.5. Karbohidratlar
Bazı besiyerlerinin bileşimine bakteriler için enerji ve karbon kaynağı olarak katılan karbohidratların bir başka kullanım şekli karbohidrat fermentasyonuna dayalı identifikasyon testleridir.
Besiyeri bileşiminde karbon kaynağı olarak en çok kullanılan karbohidratlar glukoz, laktoz ve sakkarozdur. Bunlardan glukoz pek çok bakteri tarafından kullanılabildiği için daha çok genel besiyeri bileşimlerinde yer alır.
Adonitol, arabinoz, sellobioz, sellüloz, dekstroz (= glukoz), dulsitol, galaktoz, inositol, inulin, laktoz, levuloz (= fruktoz), maltoz, mannitol, mannoz, melezitoz, mellibioz, nişasta, rafinoz, rhamnoz, sakkaroz (= sukroz), salisin, sorbitol, trehaloz, ksiloz çeşitli fermentasyon testlerinde kullanılmak üzere sıvı besiyerlerine katılabilmektedir.
Glukoz, laktoz sakkaroz, mannitol gibi bazı karbohidratlar çeşitli katı besiyerlerine yine fermentasyonun izlenmesi ve buna göre koloninin ön identifikasyonunda yararlanmak amacı ile katılır.
Koliform grup bakterilerin geliştirileceği besiyerlerinin hemen hepsinde C kaynağı olarak laktoz kullanılır. Koliform grubun geliştirilmesine yönelik olarak hazırlanmış besiyerlerinde laktozdan gaz oluşumu koliform grup için belirleyicidir.
Nişasta, kullanımı (hidrolizi) bazı bakteriler için tipik olduğundan çeşitli özel besiyerlerinin bileşimine katılır.
Karbohidratların genel olarak filitrasyon ile sterilize edilmesi önerilir. Bazı besiyerlerinin bileşimine katılan glukoz, laktoz, sakkaroz gibi bazı şekerler besiyeri ile birlikte otoklavda sterilize edilebilirler.
2.6. Tuz
Sodyum klorür, çoğu besiyerinin bileşimine izotonik bir ortam oluşturmak için katılır. Tuza dayanıklı bakterilerin selektif izolasyonu için yüksek konsantrasyonlarda özel besiyerlerinin bileşimine katılır.
2.7. Tampon Maddeler
Mikroorganizmalar genel olarak nötr ve nötre yakın pH ‘larda iyi gelişirler. Bazı mikroorganizmalar alkali pH ‘ları yeğlerken (örneğin Rhizobium bakterileri) bazıları (örneğin mayalar, küfler, asidofilik bakteriler) asidik ortamları severler.
Bir besiyerinde elden geldiğince çok sayıda mikroorganizma geliştirilmesi isteniyorsa pH nötre yakın değerde olmalı, tersine olarak geliştirilmesi istenen mikroorganizma yüksek asitliğe veya yüksek alkaliliğe dirençli (= rezistans) ise besiyeri pH’sı bu mikroorganizmanın gelişebileceği pH ‘ya ayarlanmalıdır.
Asitlik/alkalilik, besiyerlerinin selektivite kazandırılmasında çok kolay ve dolayısıyla çok yaygın olarak kullanılan bir faktördür. Örneğin maya ve küflerin, asidofilik bakterilerin geliştirileceği ortamlarda pH düşürülerek pek çok mikroorganizmanın gelişmesi kayda değer ölçüde önlenir/kısıtlanır.
Metabolizmaya bağlı olarak besiyeri pH ‘sında değişmeler meydana gelir. Bazı çalışmalarda inkübasyon sırasında pH ‘nın değişmesi geliştirilmesi istenen mikroorganizmaya zarar vereceği için istenmez. pH değişmesinin minimumda tutulması amacıyla besiyerine çeşitli tampon (buffer) maddeler ilave edilir.
Tampon olarak en çok kullanılan maddeler, fosfatlar (K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, ß gliserofosfat), karbonatlar, asetatlar ve sitrat ‘dır.
2.8. İndikatörler
2.8.1. pH İndikatörleri
Mikrobiyel metabolizma sonunda bazı besiyeri bileşenlerinden çeşitli asit veya alkali ürünler meydana gelir. PH ‘daki değişme en kolay olarak pH indikatörleri ile belirlenir ve pH indikatörlerinin renk değişimine bağlı reaksiyonlar o besiyerinde gelişen mikroorganizmalar için önemli göstergelerdir.
Aşağıda, besiyeri bileşiminde kullanılan çeşitli pH indikatörleri ve pH ‘ya bağlı renkler verilmiştir.
|
İndikatör
|
Asit pH / renk |
Alkali pH / renk |
|
Fenol blue Fenol red
Brom Cresol Green Brom Cresol Purple Brom Thymol Blue Cresol Red Litmus
Metil Red
Neutral Red Rosalic Asit
|
3,0 / sarı 6,8 / sarı 3,8 / sarı 5,2 / sarı 6,0 / sarı 7,2 / sarı 5,6 / kırmızı 4,4 / kırmızı 6,8 / kırmızı 6,8 / sarı |
4,9 / mavi 8,4 / kırmızı 5,4 / mavi 6,3 / menekşe 7,6 / mavi
8,8 / kırmızı 8,3 / mavi 6,2 / sarı 8,0 / sarı 8,2 / kırmızı
|
2.8.2. Redoks indikatörleri
En yaygın olarak kullanılan redoks indikatörü TTC (2,3,5 Triphenyl-tetrazolium chloride)’dir. Enterokokların selektif geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılır. Enterokoklar TTC ‘yi indirgeyerek kırmızı renkli bir bileşiğe (formazon) dönüştürürler. Özel besiyerinde oluşan kırmızı renkli kolonilerin enterokok kolonileri olduğu bu şekilde anlaşılır.
Resazurin, yaygın olarak kullanılan bir diğer redoks indikatörüdür.
2.8.3. Diğer İndikatörler
Mikrobiyel metabolizmaya bağlı olarak bazı kimyasalların çeşitli reaksiyonlar sonucu oluşturdukları ürünlerin belirlenmesi bu besiyerlerinde gelişen mikroorganizmaların ön identifikasyonunda kullanılır. Aşağıda bu tip reaksiyonlarda kullanılan indikatörlere örnekler verilmiştir.
– MUG (4-Methylumbelliferyl-ß-Glucuronide): E. coli tanımında son yıllarda en yaygın olarak kullanılan bir bileşiktir. E. coli ‘deki MUGase enzimi MUG ‘u UV ile fluoresans veren bir bileşiğe parçalar. MUG hakkında aşağıda 7.1.1. bölümünde ayrıntılı bilgi verilmiştir.
– Kan: Defibrine kan (çoğunlukla koyun kanı) hemoliz reaksiyonunun belirlenmesi için besiyeri bünyesine katılır.
– Lesitin: Yumurta sarısı ve soya fasulyesinde bulunan lesitin, çeşitli bakterilerdeki lesitinaz enzim aktivitesi sonunda parçalanır ve lesitin katılmış katı besiyerinde koloni etrafında berrak zonlar görülür.
– Jelatin ve kazein: Jelatin ve kazein proteolitik bakterilerin belirlenmesi amacıyla besiyeri bünyesine katılır. Proteolitik bakteri kolonileri etrafında proteoliz sonunda berrak zonlar oluşur.
– Tributirin: Lipolitik aktivitenin belirlenmesi için kullanılır. Lipolitik bakteri kolonileri etrafında lipoliz sonunda berrak zonlar oluşur.
2.9. İnhibitörler
Selektif besiyeri bileşimlerinde istenmeyen mikroorganizmaların gelişmesini engelleyen/baskılayan çeşitli inhibitör maddeler kullanılır.
İnhibitör maddelerin etki şekilleri çok farklıdır. Etkileri, öncelikle konsantrasyonlarına bağlıdır.
Bir yaklaşıma göre her maddenin yüksek konsantrasyonlarda inhibisyon etkisi vardır. Örneğin çoğu besiyerine ozmotik basınç sağlamak için katılan NaCl, yüksek konsantrasyonlarda pek çok mikroorganizmanın gelişimini engeller. Çoğu mikroorganizma için C kaynağı olarak kullanılan glukoz, % 50 konsantrasyonda ozmofilik/ozmotolerant mayaların gelişimine izin verirken, diğer mikroorganizmaların gelişimini inhibe eden bir etki yapar.
Besiyerlerinde inhibitör olarak kullanılan maddeler genel ve selektif inhibitörler olarak kabaca 2’ye ayrılabilir. Genel inhibitörler daha geniş bir spektrumda istenmeyen mikroorganizma gelişimini engellerken, selektif inhibitörler belirli mikroorganizmaların gelişimini etkiler.
İnhibisyon etki, yukarıda belirtildiği gibi öncelikle konsantrasyona bağlıdır. Bunun dışında mikroorganizma cinsi ve hatta türü inhibisyonda önemlidir. Belirli bir madde (örneğin tellurit) bazı bakteriler için inhibitör etki yaparken bazı bakteriler telluriti metalik telluriuma indirgerler, sonuçta gri-siyah renkli koloni oluşumu tipik bir morfolojik göstergedir.
İnhibitör olarak kullanılan maddenin görevi, istenmeyen mikroorganizmaların gelişmesini önlemek iken, kuşkusuz gelişmesi istenen mikroorganizma için inhibitör etki yapmamalıdır. Sadece belirli bir türün dışında tüm mikroorganizmaların gelişimini etkileyen inhibitör madde kullanımı oldukça nadirdir. Örneğin Malahit yeşili (Malachite Green) ve Cetrimide, Pseudomonas aeruginosa dışında, tüm refakatçi florayı inhibe eder.
Besiyerinde tek bir inhibitör kullanımı yerine birden fazla inhibitör kullanmak ve/veya gelişmesi istenmeyen mikroorganizmayı kısıtlı besin maddesi bulundurmak, O/R potansiyelini değiştirmek, inkübasyon sıcaklığını ayarlamak vb yöntemlerle engellemek yaygın olarak uygulanan inhibisyon şekilleridir.
İnhibitör olarak kullanılan tüm maddelerin hangi mikroorganizmalar için hangi konsantrasyonda ve hangi mekanizma ile inhibisyon etki sağladıklarını listelemek çok güçtür ve bu kitabın kapsamı dışındadır. Bununla beraber en çok kullanılan inhibitörler hakkında aşağıda kısaca bilgi verilmiştir.
– Boyalar: Metakrom sarısı (Metachrome Yellow) Proteus kolonilerinin yayılmasını; Eosin Y, metilen mavisi (Methylen Blue) gram pozitif bakterilerin gelişimini; malahit yeşili (Malachite green) Pseudomonas aeruginosa dışındaki refakatçi floranın gelişimini engeller/baskılar.
– Sodyum Azid: Gram negatif bakterilerin gelişimini engeller.
– Safra Tuzları (Bile salts, Ox bile): Gram pozitiflerin gelişimi engeller.
– Antibiyotikler: Genellikle bakterileri engellemek için geniş spektrumlu olarak küf geliştirme besiyerlerinde veya refakatçi bakteriyel florayı inhibe etmek için dar spektrumlu olarak kullanılırlar.
– Deoksiçolat (Deoxycholate): Gram pozitif bakterileri, kısmen koliformları ve zayıf olarak Shigella ‘yı engeller.
Bunların dışında selenit, tetratiyonat, bizmut, lauryl sülfat, yüksek konsantrasyonda asetat vb maddeler çeşitli besiyerlerinde inhibitör madde olarak kullanılırlar.
belgesi-787
